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    為什么不能用質(zhì)粒DNA抽提試劑來(lái)提取基因組DNA?

    發(fā)布時(shí)間: 2021-08-24  點(diǎn)擊次數(shù): 2877次

    導(dǎo)讀

        為什么同樣抽提質(zhì)粒DNA的試劑不能用來(lái)抽提基因組DNA呢?差別很大么?要買兩種試劑盒真是麻煩?。∧氵€不要不相信,有小伙伴試過(guò),還真沒(méi)抽提出來(lái)。今天小編就來(lái)和大家一起探究下原因!


    基因組DNA的抽提,一般不會(huì)用到質(zhì)粒抽提的試劑盒,究其原因是由于兩者的原理*不同。兩者不都是DNA抽提么?其實(shí)關(guān)鍵在于這兩者在實(shí)驗(yàn)的初始設(shè)計(jì)上就*不同。先給大家解釋一下質(zhì)粒抽提吧。


    質(zhì)粒抽提

    質(zhì)粒抽提通常用的是堿裂解法,一般的試劑盒都會(huì)有 SolutionⅠ,SolutionⅡ,SolutionⅢ,有的還會(huì)有 SolutionⅣ,然后是過(guò)柱子。


    SolutionⅠ

        SolutionⅠ一般都是用來(lái)重懸菌液的,會(huì)加入RNaseⅠ,降解掉里面大腸桿菌的RNA。同時(shí)里面還會(huì)用Tris-HEI體系來(lái)維持一個(gè)pH,另外會(huì)加入較大量的EDTA,去螯合掉里面二價(jià)金屬離子,使菌體本身的DNase失活。其實(shí)用雙蒸水來(lái)代替SolutionⅠ問(wèn)題也不大,關(guān)鍵就是把菌重懸起來(lái)就行。


    Solution Ⅱ

        Solution Ⅱ,一般來(lái)說(shuō)主要成分有兩個(gè),就是NaOH和SDS,NaOH主要是用于破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu),強(qiáng)堿條件下,菌體的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)、細(xì)胞的磷脂雙分子層和微囊結(jié)構(gòu)的構(gòu)相都會(huì)發(fā)生變化。而SDS在這里主要并不是起到裂解蛋白的作用,而是結(jié)合氨基酸,一般兩個(gè)氨基酸可以結(jié)合一個(gè)SDS分子。菌體裂解后,其實(shí)小片段的質(zhì)粒已經(jīng)釋放出來(lái)了,而大片段的基因組DNA還結(jié)合在蛋白質(zhì)上。


    Solution Ⅲ

        Solution Ⅲ的主要成分是醋酸鉀/醋酸緩沖液。首先長(zhǎng)時(shí)間強(qiáng)堿環(huán)境下,DNA會(huì)斷裂,所以需要用醋酸進(jìn)行中和,而鉀離子可以與SDS產(chǎn)生沉淀反應(yīng),使可溶于水的十二烷基磺酸鈉變成不溶于水的十二烷基磺酸鉀。這樣結(jié)合蛋白質(zhì)的PDS就被沉淀下來(lái)了,同樣基因組DNA也同樣被沉淀了下來(lái),用硅膠吸附釋放在上清里的質(zhì)粒,或者用無(wú)水乙醇對(duì)上清進(jìn)行沉淀,即可獲得質(zhì)粒的DNA。


    基因組DNA抽提

    而普通的基因組 DNA 抽提,首先是裂解,用離子型的蛋白變性劑:CTAB 或者 SDS 對(duì)細(xì)胞進(jìn)行裂解(加不加蛋白酶 K 其實(shí)并不太要緊),破膜的同時(shí)使得 DNA 從蛋白上解離下來(lái)。 加入高鹽溶液使蛋白質(zhì)沉淀。然后用酚仿,使蛋白質(zhì)沉淀變性在水相油相間,并分離出的可溶性蛋白。上清用異丙醇將 DNA 沉淀下來(lái),同時(shí)低溫加入一定量的一價(jià)陽(yáng)離子,可加速 DNA 沉淀。這些能和上述的質(zhì)粒抽提混為一談么?!當(dāng)然不行?。?nbsp;


    小伙伴們現(xiàn)在能明白為啥基因組 DNA 不能用質(zhì)粒抽提的試劑了吧……




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