下表列出了幾乎所有的需要注意的細(xì)節(jié)，大家可以對(duì)照自己的操作和習(xí)慣進(jìn)行檢查，也可以將圖片下載保存或者收藏，等到自己成為大師兄，就有材料“教育“小師弟啦！

工作區(qū)域：

1.細(xì)胞培養(yǎng)通風(fēng)櫥設(shè)置是否正確？

2.細(xì)胞培養(yǎng)通風(fēng)櫥所在區(qū)域有無氣流和直接出入通道？

3.工作臺(tái)面是否整潔？

4.是否僅僅放置了實(shí)驗(yàn)所需的物品？

5.開始工作前用70%乙醇擦拭工作臺(tái)面了嗎？

6.是否定期對(duì)培養(yǎng)箱、冰箱、冰柜及其他實(shí)驗(yàn)設(shè)備進(jìn)行清潔和消毒？

個(gè)人衛(wèi)生：

1.您洗手了嗎？

2.您穿戴個(gè)人防護(hù)設(shè)備了嗎？

3.如果您留了長(zhǎng)發(fā)，頭發(fā)是否扎在后面了？

4.您是用移液器操作換液?jiǎn)幔?br style="margin: 0px; padding: 0px; outline: 0px; max-width: 100%; box-sizing: border-box !important; overflow-wrap: break-word !important;"/>

5.試劑和培養(yǎng)基

6.您采用適當(dāng)?shù)姆椒▽?duì)實(shí)驗(yàn)室中配制的所有試劑、培養(yǎng)基和溶液進(jìn)行滅菌了嗎？

7.在將容器、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板和培養(yǎng)皿放入工作臺(tái)面之前，您用70%乙醇擦拭其外部了嗎？

8.試劑瓶、培養(yǎng)瓶及其他容器不使用時(shí)蓋緊了嗎？

9.是否已將所有培養(yǎng)板均放入無菌重復(fù)密封袋中？

10.是否有試劑外觀渾濁？是否污染了？試劑中是否有漂浮顆粒嗎？有難聞氣味嗎？有顏色異常嗎？如果出現(xiàn)上述情況，是否已對(duì)其進(jìn)行去污或丟棄？

操作：

1.您操作時(shí)是否緩慢、謹(jǐn)慎、注意無菌技術(shù)？

2.在將移液器、試劑瓶和培養(yǎng)瓶放入細(xì)胞培養(yǎng)通風(fēng)櫥之前，用70%乙醇擦拭其表面了嗎？

3.是否將蓋子口朝下放置在工作區(qū)域？

4.您是使用無菌玻璃吸管或者一次性無菌塑料吸管操作液體嗎？

5.無菌吸管是否僅僅使用一次以免交叉污染？

6.您是否注意到避免使吸管比較尖的一端觸碰到任何非滅菌物品包括瓶口螺紋的外緣？

7.發(fā)生液體潑濺時(shí)是否立即吸干并用70%乙醇擦拭該區(qū)域？

知己知彼，方能百戰(zhàn)不殆"了解了如何防止污染，我們還需要知道如何識(shí)別污染，畢竟，污染的細(xì)胞是要及時(shí)忍痛扔掉的，否則讓污染物集齊所有寶石，那可就……

細(xì)胞培養(yǎng)污染主要分為兩類，一是化學(xué)污染物，例如：培養(yǎng)基、血清和水中的雜質(zhì)、內(nèi)毒素、增塑劑和去污劑。二是生物污染物，例如：細(xì)菌、霉菌、酵母、病毒、支原體以及其他細(xì)胞系的交叉污染。

細(xì)菌污染

細(xì)菌外形多樣，可呈球狀、桿狀和螺旋狀。細(xì)菌和霉菌一起構(gòu)成了細(xì)胞培養(yǎng)中最常遇到的生物污染物。細(xì)胞被細(xì)菌污染后，往往一兩天內(nèi)即可通過簡(jiǎn)單的肉眼觀察發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基的pH值也會(huì)突然降低。下圖為貼壁生長(zhǎng)的293細(xì)胞被大腸桿菌污染。

霉菌污染

 霉菌污染初期培養(yǎng)物的pH值會(huì)維持穩(wěn)定，污染加重后pH值會(huì)迅速升高，導(dǎo)致培養(yǎng)基渾濁。在顯微鏡下，菌絲通體常呈細(xì)束狀纖維，有時(shí)呈較為密集的孢子團(tuán)塊。孢子在休眠期可以耐受十分嚴(yán)峻、不利的環(huán)境，因此當(dāng)霉菌污染時(shí)，一定要果斷及時(shí)扔掉細(xì)胞，防止在敷箱內(nèi)大規(guī)模污染。

酵母污染

 與細(xì)菌污染類似，培養(yǎng)基被酵母污染后也會(huì)變得渾濁，特別時(shí)進(jìn)入污染后期時(shí)。培養(yǎng)物被酵母污染后pH值變化極小，污染嚴(yán)重時(shí)才會(huì)升高。在顯微鏡下，酵母呈單個(gè)卵圓形或球形顆粒，有些會(huì)芽生出叫囂的顆粒。下圖為被酵母污染的293細(xì)胞。

病毒污染

 病毒體積極小，因而要檢測(cè)有誤病毒以及將其從細(xì)胞培養(yǎng)所用的試劑中去除都十分困難。由于大多數(shù)病毒對(duì)宿主有非常嚴(yán)格的要求，因此一般不會(huì)對(duì)與其宿主物種不同的細(xì)胞培養(yǎng)物造成不良影響。但是，使用病毒感染的細(xì)胞培養(yǎng)物時(shí)卻會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)操作者造成嚴(yán)重的健康威脅。

支原體污染

 支原體被認(rèn)為時(shí)能夠自我復(fù)制的最小生物。由于體積極小，支原體的檢測(cè)十分困難，除非達(dá)到非常高的密度，否則再次之前往往沒有明顯的感染征象。有些支原體甚至?xí)谂囵B(yǎng)物中持續(xù)存在，而不導(dǎo)致細(xì)胞死亡，但是這些支原體會(huì)改變培養(yǎng)體系中細(xì)胞的行為和代謝。慢性支原體感染的可能表現(xiàn)包括：細(xì)胞增殖速度降低、胞核密度下降以及懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞凝集。切實(shí)有效的檢測(cè)支原體污染的方法就是熒光染色、ELISA、PCR、免疫染色、放射自顯影或者微生物學(xué)測(cè)定技術(shù)定期檢測(cè)培養(yǎng)物。

交叉污染

 雖然不如微生物污染普遍，但是許多細(xì)胞系與HeLa細(xì)胞及其他生長(zhǎng)迅速的細(xì)胞系間廣泛的交叉污染是一個(gè)明確的問題。從聲譽(yù)可靠的細(xì)胞庫獲取細(xì)胞系、定期檢查細(xì)胞系的性質(zhì)以及采用良好的無菌技術(shù)是有助于避免交叉污染的慣例方法。

抗生素的使用

 細(xì)胞培養(yǎng)的時(shí)候不應(yīng)常規(guī)使用抗生素，因?yàn)槁?lián)系使用抗生素會(huì)促進(jìn)耐藥菌株的產(chǎn)生，導(dǎo)致輕度污染持續(xù)存在。一旦將抗生素撤去，這種輕度污染最終將發(fā)展成為大規(guī)模污染，而且連續(xù)使用抗生素還會(huì)掩蓋支原體感染及其他污染。因此，抗生素只能作為對(duì)付污染的最后手段，而且只能短期使用，并應(yīng)盡快撤除。

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